1.  引言

帕金森病 (PD) 是一種進行性神經退行性疾病，其主要病理特征為中腦黑質致密部多巴胺( dopamine，DA) 能神經元進行性變性丟失，導致紋狀體 DA 水平下降，在臨床上主要表現為靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢平衡障礙等癥狀。 

PD 的病因學具有多因素，包括氧化應激和腦鐵失調。目前的化學療法基本上是使用外源性左旋多巴 (LD)（DA 的直接前體）作為藥物進行對癥治療。然而，LD 給藥與三個重要問題有關：

① LD 代謝可產生細胞毒性自由基，破壞尚未受損的黑質紋狀體的多巴能神經元，可加速帕金森病的發(fā)展；

② LD 在中樞神經系統(tǒng)的生物利用度較低；

③ 在長期治療期間，給藥后 LD 的血藥濃度波動明顯，進而導致大腦內突觸間隙的多巴胺水平波動劇烈，對突觸后多巴胺受體造成脈沖樣刺激，從而導致運動并發(fā)癥的出現。

為了克服這些問題，最近合成了一種含有 LD 和天然硫辛酸部分（LA）的多功能前藥（LD-LA，圖 1）。硫辛酸很容易穿過血腦屏障 ( BBB ) 并在神經元中積累，具有抗氧化和鐵螯合特性，可以減少兒茶酚胺的自動氧化（由過渡金屬加速）和清除 LD 代謝產生的 ROS 。 

LD-LA 對帕金森病癥狀的活性及其抗氧化效率已通過體外和體內研究得到證明。此外，與 LD 相比，口服 LD-LA 延長了 LD 血藥濃度，因此這種前藥在治療與 LD 血漿水平波動直接相關的運動并發(fā)癥特別有益。然而，LD-LA 兒茶酚酯和酰胺鍵在化學和酶促作用下均被裂解，導致血漿半衰期約為 50 分鐘。因此，每天需要多次給藥以保持 LD 的有效腦水平。

在目前的工作中，將不穩(wěn)定的前藥 LD-LA 包埋在可生物降解的聚合物微球中，以保護該前藥免受酶促和化學降解，并獲得完整化合物的持續(xù)釋放。聚乳酸-羥基乙酸( PLGA ) 具有良好的生物相容性和可生物降解性，用于制備載有前體藥物的微粒。因此，它已被用于開發(fā)低分子量化合物以及治療性蛋白質和質粒 DNA 的持續(xù)藥物制劑。

由于 LD-LA 的親脂特性，PLGA 微球采用水包油乳液/溶劑蒸發(fā)法配制。研究了配方和加工參數對微球特性（大小、負載、釋放）的影響。還強調了藥物釋放前后的穩(wěn)定性以及控制 LD-LA 釋放的潛在傳質機制。

4.  儀器設備

AccuSizer顆粒計數器

品牌：美國PSS（Entegris），AccuSizer A7000系列

原理：單個粒子通過狹窄的光感區(qū)時阻擋了一部分入射光，引起到達檢測器的入射光強度瞬間降低，強度信號的衰減幅度理論上與粒子橫截面(假設橫截面積小于光感區(qū)的寬度)，即粒子直徑的平方成比例。用標準粒子建立粒徑與強度信號大小的校正曲線。儀器測得樣品中顆粒通過光感區(qū)產生的信號，根據校正曲線計算出顆粒粒徑。PSS（Entegris）的SPOS單粒子光學傳感技術，通過光散射增加對小粒子的靈敏度，將單顆粒傳感器的計數下限拓展至0.5μm。A7000AD 采用自動稀釋模式，可有效將高濃度樣品快速稀釋至合適濃度并進行檢測。

檢測關鍵點：濃度、稀釋液/分散液性質、流速。

原理圖	儀器外觀

3.  樣品制備及表征

通過油包水乳液/溶劑蒸發(fā)技術(O/W，ESE)制備了LD-LA PLGA微球(Wischke和Schwendeman，2008)。簡單地說，將 PLGA 和 LD-LA 以不同的濃度和藥物/聚合物比例(PLGA/mL DCM 為200、400、800 mg/mL DCM；藥物/聚合物比例為2%、5%或20%(w/w))溶解在DCM中，可制得 0.5 mL的油相。

對于聚合物濃度較高的溶液，在室溫下超聲處理 30 min。使用均質機，將 o-ph 與含 PVA 2%(w/w)的水相( aq-ph )乳化(30 s，室溫，25000分鐘)。將得到的乳液滴入PVA水溶液(0.5% (w/w))中;2.5 或 5 ml)，硬化浴( hb )，在室溫下磁力攪拌兩小時，使DCM蒸發(fā)和微球凝固?；蛘撸诓幌♂尩那闆r下攪拌乳液(表1)。在室溫(3min，3000×g)下離心收集微球，然后用水洗兩次，用液氮迅速冷凍，冷凍一夜進行干燥。

使用 AccuSizer A7000 AD 對微球粒徑分布進行表征分析，使用顯微鏡掃描電鏡（SEM）對 AccuSizer 測量的微球粒徑大小結果進行佐證。

4.  實驗結果

該實驗考察了配方參數(聚合物在有機溶劑中的濃度、相體積比、有機溶劑蒸發(fā)速率)對微球粒徑大小的影響。表 1 顯示，PLGA 濃度的增加導致微球尺寸和多分散性增加(例如比較 F2 和 F4)。這些現象可歸因于油相粘度的增加導致攪拌效率的降低，從而產生多分散和更大的乳化液滴，從而產生尺寸范圍相當寬的微球。

為獲得可儲存的注射劑，通常粒徑范圍控制在20-100 μm，上述所有的配方都達到目標粒徑范圍。微球的多分散性與乳液基的制備技術相關。Accusizer 測量（圖 2）表明，使用 200 mg PLGA/mL 的 DCM 溶液制備的微球具有相當窄的粒徑分布，而隨著聚合物濃度的增加 (800 mg/mL)，粒徑范圍變寬。 

使用具有高 PLGA 濃度 (800 mg/mL) 的 DCM 溶液制備的顆粒是無孔的，且與 AccuSizer 數據（圖 2）一致，顯示出相當寬的粒徑分布（圖 3，F8）。

5.  結論

關鍵配方和加工參數會影響微球的粒徑大小和孔隙率，從而影響藥物釋放速率。有機相中的聚合物濃度、相體積比和水相與有機溶劑的預飽和度對攪拌效率和油滴凝固速率具有重要影響，從而影響微球粒徑大小、多分散性和孔隙率。使用AccuSizer A7000 系列可快速、準確測量粒徑大小和粒徑分布、從而篩選配方，節(jié)省研發(fā)時間。

參考資料

[1] E. D’Aurizio, C.F. van Nostrum, M.J. van Steenbergen, P. Sozio, F. Siepmann, J. Siepmann,W.E. Hennink, A. Di Stefano；Preparation and characterization of poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres loaded with a labile antiparkinson prodrug.